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January 14, 2022

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欧亿5首页_欧亿5登陆地址_FITC&AMC等荧光标记技术

       
荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物,受到紫外光或蓝紫光照射时,可激发成为激发态,当从激发态恢复基态时,发出荧光。荧光标记技术指利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上,利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记的无放射物污染,操作简便等优点,使得荧光标记物在许多研究领域的应用日趋广泛。人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性,并将其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发(例如,各种激酶、磷酸酶、肽酶等)。肽谷生物经过长期开发,能够提供技术成熟的各种荧光标记多肽。

下面是一些常见的多肽修饰荧光物质结构:

下表是一些荧光物质的激发光波长Ex(nm)和发射光波长Em(nm):

荧光基团

激发光波长Ex(nm)

发射光波长Em(nm)

羟基香豆素

325

386

丹磺酰氯

340

578

AMC

345

445

甲氧基香豆素

360

410

Alexa fluor 系列

345

442

氨基香豆素

350

445

Dabcyl

453

Cy2

490

510

FAM

495

517

Alexa fluor 488

494

517

FITC

495

519

Alexa fluor 430

430

545

5-FAM

492

518

Alexa fluor 532

530

555

HEX

535

556

5-TAMRA

542

568

Cy3

550

570

TRITC

547

572

R-phycoerythrin(PE) (489)

565

578

Rhodamine Red-X

560

580

Tamara

565

578

Alexa fluor 555

556

573

Alexa fluor 546

556

573

Rox

575

602

Alexa fluor 568

578

603

Texas Red

589

615

Alexa fluor 594

590

617

Alexa fluor

621

639

Alexa fluor 633

650

668

Cy5 (625)

650

670

Alexa fluor 660

663

690

Cy5.5

675

694

TruRed 490

675

695

Alexa fluor 680

679

702

Cy7

743

767

Cy3.5

581

596

1. FTIC修饰

     FITC(异硫氰酸荧光素)具有比较高的活性,我们公司可以通过两种方式将FITC标记于多肽上:(1) 将FITC标记于赖氨酸(Lys)或被选择性地脱保护的鸟氨酸(ornithine)侧链氨基上;(2) 将FITC标记于多肽N端氨基。
     
当在N端标记时,建议在后一个氨基和由异硫氰酸酯与氨基反应产生的硫脲键之间引入烷基间隔器(alkyl spacer)如氨基己酸(Ahx)。链接切割需要酸性环境,在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素,通常会伴有后一个氨基酸的去除,但当有一个间隔器如氨基己酸,或者是通过非酸性环境将目的肽从树脂上切下来时,这种情况可避免。空间位阻被认为是在荧光染料前使用Ahx的主要原因,而不是为什么FITC不能直接偶联在多肽上的原因。
      Ahx
或b-Ala均可作为间隔器用于FITC标记的多肽上。

2. AMC修饰

AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)是一种应用广泛的荧光标记试剂, 与其他荧光染料不同的是,AMC修饰多肽分子是从C端进行:
     
(1)AMC与肽链C端个氨基酸反应;
     
(2)固相合成整条肽链(从第二个氨基酸开始),并且保留整条肽链的侧链保护基和后一个氨基保护基;
     
(3)液相缩合AA-AMC与全保护的肽链;
     
(4)切除保护基,完成肽链的修饰。

      通常,生物素、FITC等染料可任意标记在多肽N端或C端。但我们推荐N端标记,其成功率更高、所需时间更短、更易操作。由于多肽都是从C端往N端合成,所以N端修饰将是固相合成的后一步,不再需要额外的偶联步骤。相反,如果是C端标记,则需要附加步骤,而过程会更复杂。
     
大多数染料都是大型的芳香分子,如此庞大分子的介入有助于避免标签和多肽之间的相互作用。这将有助于保持多肽的构象和生物学活性。一般来说,推荐引入一个柔性间隔如Ahx(一个6碳化合物)会使荧光标记更加稳定。否则FITC将很容易与其他任何位置的半胱氨酸的巯基或赖氨酸的氨基发生连接。